Μετά τη Μάχη του Γρανικού και τη λύση του Γόρδιου Δεσμού, ο Μέγας Αλέξανδρος ολοκλήρωσε την κατάκτηση της Μικράς Ασίας και στράφηκε προς τη Συρία. Ο Δαρείος ανησύχησε και συγκρότησε -σύμφωνα με τον αρχαίο ιστορικό Αρριανό- ένα πανίσχυρο στρατό, αποτελούμενο από 600.000 πεζούς (ανάμεσά τους και 30.000 έλληνες μισθοφόροι), και 100.000 ιππείς. Οι αριθμοί φαντάζουν υπερβολικοί για τους σύγχρονους ιστορικούς, που υποστηρίζουν ότι η δύναμη των Περσών δεν πρέπει να ξεπερνούσε τις 100.000 άνδρες. Επικεφαλής τους τέθηκε ο ίδιος ο Δαρείος, παρά τις περί του αντιθέτου εισηγήσεις των ελλήνων συμβούλων του.
Η αποφασιστική αναμέτρηση δόθηκε στις 12 Νοεμβρίου 333 π.Χ. στη στενή πεδιάδα, που ορίζεται από τον κόλπο της Ισσού και το όρος Ακμανός, κοντά στην πόλη Ισσό της Κιλικίας (σημερινό Ισκεντερούν της Νοτιοανατολικής Τουρκίας). Ο Αλέξανδρος με το ένα τρίτο των δυνάμεων του Δαρείου εφάρμοσε την προσφιλή του τακτική της λοξής φάλαγγας, όπως και στη Μάχη του Γρανικού. Παρέταξε τις δυνάμεις του στην αντίπερα όχθη του ποταμού Πινάρου, έτσι ώστε να καλύπτουν όλο το πλάτος της εχθρικής παράταξης. Ο Δαρείος επανέλαβε το λάθος του Γρανικού. Παρέταξε τον πολυπληθή στρατό του σε στενό χώρο κι έτσι δεν είχε περιθώριο ελιγμών.
Ο Αλέξανδρος διάβηκε πρώτος τον ποταμό και κατόρθωσε να αποκόψει την αριστερή πτέρυγα του εχθρού. Αυτή υποχώρησε και άφησε ακάλυπτο το κέντρο, όπου η Μακεδονική φάλαγγα είχε διαρραγεί από τους έλληνες μισθοφόρους, οι οποίοι τώρα πλήττονταν και από τα πλάγια. Ο Δαρείος πανικοβάλλεται και τρέπεται σε άτακτο φυγή, συμπαρασύροντας και τον στρατό του. Στο πεδίο της μάχης ο πέρσης μονάρχης αφήνει μητέρα και σύζυγο, οι οποίες αιχμαλωτίζονται, καθώς και πολλά λάφυρα. Μεγάλες ήταν οι απώλειες και για τους δύο αντιπάλους. Οι Πέρσες έχασαν 30.000 άνδρες και οι Μακεδόνες 7.000.
Η νίκη του Αλεξάνδρου στην Ισσό εδραιώνει τη φήμη του ως μέγα στρατηλάτη και καταρρακώνει το ηθικό των Περσών. Στη συνέχεια θα καταλάβει τη Φοινίκη, την Παλαιστίνη και την Αίγυπτο και έχοντας εξασφαλίσει τα νώτα του και τον έλεγχο όλης της Ανατολικής Μεσογείου θα στραφεί προς το εσωτερικό της Ασίας, όπου θα αναμετρηθεί εκ νέου με τον Δαρείο στη Μάχη των Γαυγαμήλων (331 π.Χ.).
